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Cellsorter亚纳升精密压电吸管用于单细胞分离和液滴打印

发布时间:2022-01-10 点击量:284

 

尽管使用手持式移液管处理微升级液体是一项常规任务,但由于表面张力、粘附力和蒸发效应等技术难题,移液纳升级体积具有挑战性。Cellsorter开发了一种全自动压电微移液管,精度<1纳升,将基于成像的单细胞分离效率提高到90%以上。这一改进在分离稀有或珍贵细胞时至关重要,尤其是在医疗应用中。紧凑的压电微移液管可以集成到各种(生物)化学工作流程中。它消除了塑料管、阀门、注射器和压力罐对于样品的高质量相衬照明,例如细胞或微小液滴.Cellsorter构建了与微移液管同心排列的LED环。同样的装置可以在显微镜上使用荧光或透明照明,方便地用于试剂的单细胞打印和纳升级液滴打印。Cellsorter设想这项新技术不久将成为医学诊断中单细胞操作的标准工具,例如循环肿瘤细胞分离。

在实验室中,毫升(ml)或微升(μl)刻度的液体处理是一项常规任务,例如,使用手持移液管。然而,0.1μl以下的处理量是一个挑战。如果液滴的尺寸小于毛细管长度,则微小液滴的动力学主要取决于重力作用下的表面张力。对于标准温度和压力下的水和空气界面,毛细管长度约为2 mm。小液滴与移液管固体表面之间的粘附力在该长度范围内也至关重要。小水滴的快速蒸发是另一个困难。在流体系统中,密封将流体保持在管道或通道内。在大多数情况下,密封件由软弹性材料制成:各种橡胶或PTFE。由于流体部分被弹性材料包围,因此在微观尺度上控制其体积很麻烦。然而,当试剂的体积受到限制时,例如在单细胞测量中,纳升(nl)或皮升(pl)级液体处理是一个主要优势。

微流控芯片处理微小体积流体的简单解决方案是使用具有微米大小通道的微流控芯片来传导水溶液。将微流体集成到复杂芯片中是非常有前景的,其主要目标是实现芯片上实验室系统。基于液滴的微流体(Guo等人2012;Köster等人2008;Agresti等人2010;Brouzes等人2009;Leung等人2012)处理悬浮在石油环境中的亚纳米级水滴。然而,目前可用的微流体存在许多技术缺陷(Leung等人,2012年)。这些芯片对介质的固体污染非常敏感。需要使用含有适当表面活性剂的特殊且昂贵的油来维持稳定的乳液。在大多数情况下,实现流量的适当稳定性是一项挑战,更不用说在试验前和试验后的瞬态效应了, 液滴内捕获的单个细胞可以单独进行DNA条形码编码、汇集和随后测序(Lee等人,2016年)。然而,在这个过程中,单个细胞的表型信息丢失了。因此,DNA/RNA序列不能与肿瘤或发育组织中特定细胞的作用相关。

压电液滴系统可以通过微移液管注入nl或pl大小的液滴(www/scienion/com/; www/cytena/com)。注射器中的压电致动器产生压力波,从毛细管中注入液滴。注射器不能像手持式移液管一样在同一周期内抽取和沉积小体积的液体。此解决方案仅在空气中有效。压电注射器机器人可用于打印,但不能用于流体的pl–nl 级采样。

使用玻璃微移液管的微注射器和FluidFM微注射/精确到飞秒级是细胞生物学中一项众/所/周/知的技术(Takagi et al.2007)。也可以使用微流控原子力显微镜(FluidFM)进行微注射(Meister等人,2009年)。但是,微型喷射器不能以高精度拉动和喷射相同的流体。由于长,宏观弹性管和密封,当他们拔出液体后开始注射时,这些设备工作时有很大的滞后.

SODA机器人——机器人(Zhu等人,2013年)使用由注射泵控制的1μl Hamilton注射器,并连接到带有1厘米泰贡管的玻璃微量移液管,从而将拉注过程的误差降至更低。然而,这种zui/先/进的设置很难常规应用。即使在这个专门的系统中,拉和沉积循环也只能实现纳升精度。SODA机器人的热体积波动也很明显。SODA机器人的另一个缺点是汉密尔顿注射器和毛细管之间固有的1厘米短管,导致难以操作的设置。该装置的速度受注射泵的速度限制。SODA机器人的最终精度也受到汉密尔顿注射器和注射泵的限制。

根据显微图像使用微量移液管拾取细胞进行单细胞分离是一种成熟的方法(Kurimoto等人,2006年;Hosokawa等人,2009年)。为了提高通量和效率,在过去几年中出现了应用电动显微镜和微操作器的半自动化技术(Schneider等人,2008年;Yoshimoto等人,2013年;Környei等人,2013年)。商用微移液管法的液体处理精度受到将微移液管连接至真空罐的长(~1 m)塑料管的限制(Környei等人,2013年;Salánki等人,2014a;Ungai Salánki等人,2016年)。管的弹性导致纳升级流体流动的滞后。微移液管中的流量不仅受压力罐中的真空或超压的影响,还受管的弹性膨胀的影响。尽管这一限制可以在研究实验室处理,以实现单细胞RNA测序(Kozlov等人2017;Ngara等人2018)、循环肿瘤细胞(CTC)分离(Winter等人2018)的结果,蛋白质工程(Piatkevich et al.2018)或单细胞粘附实验(Salánki et al.2014b;Sándor et al.2016;Ungai Salánki et al.2019),妨碍了它们在医学诊断中的常规应用。

尽管如此,阀控射流系统的简单性和灵活性仍有几个优点,包括其应用恒定、稳定和高真空的能力,以及由此产生的高流体动力。如果需要,可将微移液管收集的液体体积设置为高(几微升)。这在分离强粘附细胞或测量细胞粘附力时非常有用。当前开发的背景是阀控细胞分选仪(www/singlecellpicker/com/valve-control)在电动显微镜上工作。真空罐和超压罐通过两个高速流体阀与垂直微量移液管相连。在Petri培养皿中扫描样本并用计算机视觉或手动检测细胞后,微移液管通过打开微移液管和真空罐之间的阀门逐个拾取所选细胞。然后,通过打开超压罐和微量移液管之间的阀门,将单个细胞沉积到PCR管中(Környei等人2013;Salánki等人2014a)。

在目前的工作中,Cellsorter优化并应用了基于微移液管的装置,以最小化其拾取体积并最大限度地提高其精度。Cellsorter开发了一种全自动、紧凑的压电微移液管,结合高分辨率成像和<1nl液体处理精度(CellSorter Kft(2019)压电微移液管PCT专/利申请HU 2019/000002)(www/singlecellpicker/com/piezo-head)。它消除了塑料管、阀门、注射器和压力罐的影响。它可以分离敏感或稀有细胞或效率>90%的细胞。可用于nl级液滴打印,包括单细胞打印

打开压电吸管并将压电头固定在显微镜(蔡司)上后,校准压电致动器,cellsorter测量了压电致动器(PI Ceramic P-885.11)自由端的位移,作为电压的函数,从0 V开始到+100 V,然后从+100 V回到0 V。相邻测量点之间的电压阶跃以50ms线性斜坡施加。Cellsorter在每个施加电压步骤后捕获致动器的图像,并将所有图像与在0 V电压下捕获的第一张图像进行比较,以计算位移。Cellsorter用线性曲线拟合完整数据:y=0.0727±0.0055[μm/V]x+0.9502μm;R2=0.9008。产生的7.3μm/100 V在供应商(PI Ceramic)规定的范围内

校准压电微移液管以量化压电微移液管的液体处理精度,首先,Cellsorter在疏水35 mm皮氏培养皿(Greiner)中在2 ml矿物油中生成水滴。对于±50 V(100ms线性斜坡)的较大电压,使用0.5μl Hamilton注射器沉积约0.1μl水滴。为了测试±5±10 V(100ms,线性斜坡)的较低电压,使用内径(内径)为30μm的微移液管,使用1×1 mm2 NBR 70 O形环和+100 V制备约20 nl水滴。产生液滴后,微移液管靠近培养皿表面,距离液滴内部100μm。Cellsorter用10倍或20倍的物镜测定水滴体积的变化。Cellsorter将显微镜聚焦在液滴底部,并测量液滴与培养皿之间界面的d1直径,即液滴中缺失的球形帽的直径。Cellsorter拍摄了液滴的图像,并在其轮廓上画了一个圆圈。Cellsorter还测量了球形液滴的D1直径(图1c)。然后Cellsorter施加正或负电压阶跃。测量至少重复三次。Cellsorter再次测量了液滴底部的d2直径和球形液滴的d2直径。Cellsorter根据d1、d1、d2和d2计算液滴体积,如下所示:

Vdroplet = Vsphere − Vspherical cap, where (1)

Vspherical cap = hspherical cap ∗π/6(3r2 + h2spherical cap), where(2)

h spherical cap = R1,2 −√(R21,2−r21,2), where(3)

R 1,2 =D1,2/2, (4)

r1,2 =d1,2/2 (5)

 

Cellsorter用线性函数拟合测量数据。作为施加电压阶跃ΔU(V)函数的液滴ΔV(nl)体积变化如下:ΔV=0.21*ΔU− 0.1329; 斜率:0.21±0.08 nl/V,R2=0.9929。

使用内径为30–70μm的微移液管,使用3.5×1.1 mm2 FPM O形环(超级密封),通过在矿物油或氟化油下在35 mm亲水塑料培养皿(Greiner)中施加40–100 V(100 ms,线性斜坡)的电压阶跃,沉积油水珠下的纳升液滴打印。这些液滴被认为是球形帽。为了计算亲水表面上水滴的体积,Cellsorter测量了几个代表性水滴的接触角(θ):

sin θ= 2hr/(r2 + h2)    (6)

液滴高度(h)与表面上液滴直径(2r)之比为0.49±0.05,因此θ=82°±5°。然后,Cellsorter只测量了液滴的(2r)直径,并计算了它们的体积,如下所示:

V =πh (3r2 + h2) /6  (7)

where h = 0.98 ∗ r.

Cellsorter还根据压电致动器的校准位移和O型环的尺寸计算了移液管的完整(理论)体积Vfull(nl),如下所示:

V  full = 0.0727 ∗ ΔU ∗ (RO-ring + rO-ring)2 ∗π,(8)

式中,RO环为O型环内径的一半,rO环为O型环高度的一半

测量压电微移液管中的流体流量波动Cellsorter使用1×1 mm2 NBR 70 O形环测量了内径为30μm的微移液管中的流体流量波动。压电头包括致动器和微量移液管,通过磁性支架水平固定在配备5×物镜的显微镜上。在内径为1.2mm的玻璃管中填充2μm荧光红色颗粒(Spherotech)悬浮液,该悬浮液在0.1%Triton-X-100中稀释至200倍。玻璃管的两端用一滴矿物油封闭,以防止水悬浮液蒸发。微量移液管进入试管,直到它到达珠子悬浮液。Cellsorter每隔30秒记录一次珠子的运动。Cellsorter在这些间隔内对压电致动器施加正负电压阶跃,并在显微镜上观察其效果。

粒子跟踪测速仪(PTV)和流量计算Cellsorter使用PTV来计算由电压阶跃触发或由无电压阶跃的波动驱动的玻璃微移液管中的流量。在每段视频中,Cellsorter可以跟踪约20颗珠子。Cellsorter使用免费的视频到JPG转换器将视频中的帧提取到JPG文件中。Cellsorter使用了TrackMate ImageJ插件(www/imagej/net/Getting_started_with_Track Mate),以分析珠子的轨迹。为了检测图像中的珠子,Cellsorter使用了高斯差分法(DoG检测器),这是一种可用于斑点检测和跟踪的特征增强算法。DoG是一种带通滤波器,用于去除代表噪声的高频分量和代表图像中较大均匀区域的一些低频分量。在第一帧中正确检测到珠子后,Cellsorter使用简单线性分配问题(LAP)跟踪器粒子链接算法。Cellsorter将珠子轨迹保存在xml文件中,以便使用MATLAB代码对其进行分析,以计算下面描述的数量。柱面坐标系固定在微量移液管的轴上,从微量移液管尖/端测量轴向坐标X,径向坐标R(图2a)。珠子的径向位移可以忽略不计。Cellsorter计算了轴向位移(图2d):

图1压电微量移液管。带有弹性管和注射器的标准微量移液管。压电微移液管的示意图。顶部的压电致动器被推到尺寸在[1–6]×1 mm范围内的O形圈上。玻璃微移液管通过垂直通道连接到O形圈的内部体积。这些都装满了水。相位对比度照明由与微移液管同心排列的一圈LED提供。c校准原理。当使用1×1 mm2 O形环向压电元件施加电压时,Cellsorter测量了先前沉积在油下疏水表面上的水滴体积的变化。根据电压阶跃前后的液滴直径(D1,D2)和接触面积直径(D1,D2),Cellsorter计算了作为施加电压函数的体积变化(补充图3)。结果,Cellsorter获得了斜率为0.21±0.08 nl/V(d)的校准曲线。e–g纳升液滴打印。e使用内径为70μm的移液管(3.5×1.1 mm2 O形圈)在矿物油下打印+75 V(100 ms,线性斜坡)的水滴。根据[0]中压电致动器f的位移→ 100 V](矩形)和[100→ 在0 V(圆形)范围内,Cellsorter计算了带有3.5×1.1 mm2 O形环的移液管的完整体积变化。压电位移的滞后在0→ + 100→ 0伏航向。打印液滴g的体积非常均匀(补充图4)。由于水和油之间的表面张力,它低于计算的移液全体积,并且取决于微移液管的直径(30、50、70μm)。当从微移液管中推出液滴时,由于表面张力,水和油界面处的拉普拉斯压力与微移液管的直径成反比。对于I.D.30、50和70μm微量移液管,Cellsorter能够成功应用于打印液滴的最小电压分别为80、50和40 V(Cellsorter没有在80 V下使用I.D.50和70μm微量移液管)

 

Δx(t) = x(t) − x(t −Δt),(9)

平行于微量移液管轴线的珠子。Cellsorter计算了珠子的轴向速度:

v(t) =Δx(t)/Δt  (10)

图2压电微移液管中的流量波动。从侧面看微移液管的几何形状。Cellsorter测量了内径为30μm的微量移液管的锥角(α=6.3°)及其孔径半径(R0)。圆柱坐标系固定在微移液管的轴上,从微移液管尖/端测量轴向坐标X和径向坐标R。微移液管的壁在b中用白色虚线表示。Cellsorter将微移液管放入另一个直径为D=1.2 mm的玻璃管中。这个外管充满了水,其中含有2μm的荧光珠,在图像左侧显示为白点。外管内的水相两端被一滴油堵塞,以避免蒸发。红色虚线表示左侧的水和右侧的油之间的界面。当微移液管从右侧向内推入外管并到达水相时,微珠进入微移液管。Cellsorter跟踪并分析了移液管(c)中微珠的运动。d微移液管中六个选定微珠的位移随时间的变化。在5分钟时施加+6 V的电压阶跃。Cellsorter根据微珠位移和微移液管的几何形状计算流速e。从微量移液管流出的流体的计算体积如f所示(见补充视频1,2)

由于微珠的密度较低,Cellsorter无法在移液管中完全采样抛物线速度分布。因此,Cellsorter使用以下公式计算基于最快胎圈的估计流量(图2e):

Q(t) = v(t) ∗ A(x) (11)

式中,A(x)是特定珠粒位置处微量移液管的横截面(图2a):

A(x) = R pipette(x)2 ∗π, (12)

R pipette = (x + x0) tgα/2, (13)

x0 =R0/tgα/2  (14)

最后,Cellsorter计算流量V作为流量Q的时间积分(图2f):

ΔV(Δt) =0Δt Q(t)dt. (15)

3T3细胞培养小鼠胚胎成纤维细胞(ATCC;CCL-92)在补充有10%FCS(Sigma)的MEM中按照ATCC细胞生物学收集指南生长。用亲脂性荧光染料DiI(10μM,37℃下30分钟,体外培养)对细胞亚群进行染色。在分选之前,3T3细胞在37℃下用1×胰/蛋/白酶-EDTA溶液(Gibco,25300)处理6分钟;然后,将细胞悬浮液以300 g离心2分钟(Ungai Salánki等人,2016)。

Jurkat细胞培养根据ATCC细胞生物学收集指南,永生化人类T淋巴细胞系(ATCC;TIB-152)在补充有10%FCS(Sigma)的RPMI-1640培养基中生长。用亲脂性荧光染料DiI(100μM,37℃下15分钟,体外培养)对细胞亚群进行染色;然后,以1500 RPM的转速离心5分钟。

HT-29细胞培养根据ATCC细胞生物学收集指南,将HT-29大肠腺癌细胞系(ATCC;HTB-38)培养在补充有10%FCS的McCoy 5A培养基中。在分选之前,用1×胰/蛋/白酶-EDTA溶液(Gibco,25300)在37℃下处理HT-29细胞5分钟;然后,以900 RPM的转速离心细胞悬浮液5分钟。

3D打印微孔到皮氏培养皿Cellsorter将高度为1 mm的微型多孔板打印到塑料皮氏培养皿(Greiner)中。Cellsorter使用定制改进的商用3D打印机(Ultimaker)在35 mm皮氏培养皿中打印四个5×5 mm2正方形的4孔板(Ungai Salánki等人,2016)。

PDMS微孔Cellsorter用聚二甲基硅氧烷(PDMS,Dow Corning Sylgard 184)制备了四个5×5 mm2微孔,用于模制4孔嵌件。PDMS弹性体和固化剂以10:1的比例混合,并模塑成由聚甲醛(POM)制成的模塑形式。PDMS在室温下聚合过夜,并从模塑形式上剥离。Cellsorter将高度为1 mm的PDMS插入物放入疏水培养皿(Greiner)中。

在微孔中创建一薄层细胞悬浮液,Cellsorter用20μl细胞培养基覆盖所有四个微孔,以湿润疏水性35 mm皮氏培养皿的表面。Cellsorter从孔中取出多余的培养基,用于从中提取细胞。Cellsorter在皮氏培养皿中加入2毫升矿物油(sigma)。将添加10%FCS的10-15μl培养基中的1500-50000个细胞注射到皮氏培养皿中的一个5×5 mm2微孔中。

从细胞悬浮液中自动分离单细胞Cellsorter使用自动微量移液管装置(细胞分选机)(Környei等人2013;Salánki等人2014a)在显微镜上检测和分离单细胞。压电致动器(PI陶瓷)控制微移液管的体积。内径为30μm的微移液管被Sigmacote(Sigma-Aldrich)包覆,以避免细胞粘附在微移液管壁上。Cellsorter将微量移液管插入压电头,并用去离子水填充。Cellsorter用微量移液管的尖/端接触培养皿的表面,以精确校准其垂直位置(Környei等人,2013)。Cellsorter通过捕获覆盖整个或部分5×5 mm2的马赛克图像来扫描感兴趣区域。使用CellSorter软件中实现的局部方差图像分割方法,通过计算机视觉检测荧光细胞。为了优化细胞选择,可以手动调整检测参数(包括灵敏度、细胞亮度范围和细胞大小)。选择要分离的细胞格后,Cellsorter运行排序过程。在提取第一个细胞之前,将培养基放入微量移液管中,以避免细胞的渗透休克。为了实现精确的细胞定位,Cellsorter使用自适应细胞定位校正了细胞坐标(Ungai Salánki等人,2016)。为了拾取和沉积单个细胞,Cellsorter施加了分别为6伏(100毫秒,线性斜坡)和+30伏(2000毫秒,线性斜坡)。在将细胞沉积在比Cellsorter用于拾取的体积更大的体积中之后,Cellsorter需要将移液管重置到其初始位置(电压)。因此,Cellsorter在无细胞培养基储存库中,通过应用− 24伏(2000毫秒,线性斜坡)。当拾取细胞时,尖/端位于皮氏培养皿表面上方30μm处,当将细胞沉积在贮存器中时,尖/端位于皮氏培养皿表面上方50μm处。沉积区域选择在4孔微孔板的第二个孔中。Cellsorter把第三口井用作水库。单细胞分离的所有步骤均由软件(CellSorter)完全自动控制完成。

细胞活力测定Cellsorter使用HT-29细胞量化了单细胞分离程序对细胞活力的影响。细胞在新的组织培养皮氏培养皿中沉积并进一步培养。分离的细胞在37°C的5%CO2中培养2小时,然后过夜。2小时后,首先通过计数具有正常粘附形态的细胞来检查存活率。隔夜培养后,更换培养基,并在显微镜上计数完全铺展的细胞。如果一个细胞在皮氏培养皿中的培养时间内分裂,它仍然只被算作一个细胞。

Cellsorter开发了一种紧凑的压电微移液管(图1,补充图1,2),可以轻松地自动化并集成到各种(生物)化学工作流程中。它消除了塑料管、阀门、注射器和压力罐的影响(Környei等人,2013年;Salánki等人,2014a;Ungai Salánki等人,2016年)。 其操作类似于滴管或手持移液管。对于样品的高质量相衬度(Ph1和Ph2)照明,例如细胞或微小液滴,Cellsorter构建了与微移液管同心排列的LED环。因此,Cellsorter的方法可以完全自动化使用荧光或相衬照明活细胞。微移液管(锋利的玻璃毛细管)连接到压电致动器。移液管的体积范围由压电致动器和玻璃微移液管之间的O形圈设置。Cellsorter采用了各种NBR 70 O型环,包括1×1、3×1、4×1和6×1(内径×高度)mm2尺寸,在1-50 V工作电压范围内,其近似范围为[0.2-10]、[0.8-40]、[1.2-60]和[2.5-125]nl。压电致动器(图1b)的膨胀推动并变形O形圈,从而减小其内部体积(补充图2)。它导致流体在微移液管中流动,最后从微移液管流出到皮氏培养皿。当压电致动器收缩时,微量移液管从皮氏培养皿中吸出液体。液体处理精度由压电致动器和移液管中的热波动决定。

Cellsorter使用一种简单的方法校准压电吸管,方法是在显微镜上将水注入油环境中的水珠中(图1c,d,补充图3)。Cellsorter通常可以在以下情况下达到亚纳升精度:移液体积在0.5-10 nl范围内(表1)。

Cellsorter使用3.5×1.1 mm2的O形圈将压电吸管用于nl液滴打印。Cellsorter在油下将水滴打印成网格图案(图1e,补充图4)。液滴的横向坐标由软件设定,整个打印过程无需人工干预。打印nl液滴形成的任何2D图案都可以以类似的方式进行。Cellsorter测量了打印液滴的体积(图1e,g),并将其与根据压电致动器的位移(图1f)计算的移液管的完整体积变化进行比较。压电位移在0→ + 100→ 0伏航向。Cellsorter可以通过压电电压在10–60 nl范围内控制打印液滴的体积。打印液滴均匀,标准偏差为几nls(图1g)。液滴的体积低于计算得出的吸液全体积,这取决于微吸液管的直径,因为水和油之间的表面张力。(将水推回移液管的拉普拉斯压力与移液管直径成反比。)

Cellsorter使用一个1×1 mm2的O形环,用荧光微球的粒子跟踪测速法定量了微量移液管中流体流动的微观波动。荧光微球放在玻璃管内,末端带有矿物油塞,以避免蒸发(图2a,b)。Cellsorter放下微量移液管,在显微镜上观察微珠的运动。Cellsorter记录了珠子的运动(补充视频1、2),并使用ImageJ TrackMate软件插件进行分析(www/imagej/net/Getting_start ed_with_Track Mate(图2c)。Cellsorter在每个实验中跟踪观察了约20个珠子,并计算了珠子的位移作为时间的函数(图2d)。根据胎圈位移确定流速和流量(图2e、f、补充图5)。峰值的估计流速为373±29 pl/s,平均体积波动率为36±6 pl/s,因此信噪比为10。

Cellsorter使用1×1 mm2 O形环将压电吸管用于单细胞从悬浮液中分离。细胞被保存在一层薄薄的培养基上,上面覆盖着油,以尽量减少液体的流动和培养基的蒸发。Cellsorter采用适应性细胞靶向(Ungai Salánki et al.2016)来利用内径为30μm的微移液管实现适当的细胞靶向(图3a-D)。Cellsorter使用了三个独立的孔:一个用于拾取,第二个用于沉积细胞,第三个用于重置压电移液管。Cellsorter施加的电压为− 6V(100ms,线性斜坡)以拾取体积为1.25±0.48nl的单个细胞。Cellsorter可以将单细胞分离的效率从以前的约75%(Ungai Salánki et al.2016)提高到90%以上,而无需移除任何相邻细胞。3T3、Jurkat和HT-29细胞的单细胞拾取效率分别为95±1.2%(n=82)、96±5.8%(n=48)和91±0.8%(n=33)(图3f-h)。Cellsorter以6 nl的较大体积沉积细胞,以达到100%的沉积率(图3e)。细胞分选的空间分辨率为29±3.6μm,也就是说,距离目标细胞较远的细胞未被移除(图3i,j)。

 

Cellsorter量化了分离的单个细胞在分离后2小时和1天的存活率。分离2小时后,93±3%的研究(n=30)细胞存活。隔夜培养后,83±9%的分离细胞存活。

表1压电微移液管的校准

Voltage (V)

−5

+5

−10

+10

−50

+50

Volume (nl)

(mean ± SD)

−0.64±0.38

+0.78±0.35

−1.44±0.56

+1.24± 0.51

−11.05±1.53

+10.31±0.95

Cellsorter通过在显微镜上将水注入(或从)先前沉积在矿物油下的水滴(或从中拉出)作为施加电压的函数来校准压电微移液管。当正电压步骤导致注射时,负电压步骤将水拉入微量移液管(图1c,d)。Cellsorter通过测量施加电压前后液滴的直径和接触面积的直径来计算液滴体积的变化(补充图3)。Cellsorter使用了一个1×1mm2的O形圈

 

图3单细胞分离。单细胞分离前(a)和后(b)的小鼠成纤维细胞。c、 d放大a、b中虚线框定的区域。I.d.30μm微移液管的尖/端显示在a的角/落。/选择分离的标记单元格中的黄色框。红框中彼此太近的细胞被软件排除在外,以避免拾取多个细胞。相同位置的框架如b所示。图像比较表明,即使由于培养皿中的流体对流,细胞从初始位置移位,目标细胞也可以很容易地分离出来,而不必拾取红色框架中的细胞。整个隔离过程可以被跟踪并保存在实时取景摄像机图像中,用于回顾和记录实验。在e中,选择24个单个Jurkat细胞分离成网格模式,细胞之间的距离为500μm。由于拾取#12和#23单元格失败,网格的相应位置为空。在Cellsorter测试的所有细胞类型中,单细胞分离f–h的效率都在90%以上。i在微孔中混合50个荧光细胞和50000个未标记细胞的细胞培养区域的红色荧光和相位对比度图像的组合图片。用显微移液管(如图角所示)采集荧光细胞。四个相邻的细胞也被移除,如拾取后拍摄的图像j所示。通过测量靶细胞中心与最远移除细胞中心之间的距离,Cellsorter计算了分选的空间分辨率(R):R=29±4μm

Cellsorter开发并校准了用于纳升范围内液体处理的压电微移液管。移液管的工作原理和几何形状非常简单。它包含一个由压电致动器变形的弹性O形圈(CellSorter Kft(2019)压电微移液管PCT专/利申请HU 2019/000002)。移液管的体积范围由O形环的直径设置;因此,通过更换O型环,相同的装置可以应用于不同的体积范围。对微移液管的校准证明,通过应用~[5–50]V,该装置可以在[1–10]nl范围内可靠地使用。Cellsorter使用粒子跟踪测速仪测量了微移液管的皮克级波动。平均体积波动率为36±6 pl/s,导致信噪比为10。

Cellsorter将该装置应用于油下纳米级水珠打印。Cellsorter可以通过压电电压在[10–60]nl范围内控制打印液滴的体积。打印液滴均匀,标准偏差为几nls。Cellsorter还将该装置用于单细胞分离。它将基于成像的单细胞分离效率从以前的75%提高到90%以上。这一改进在分离稀有或珍贵细胞时至关重要,尤其是在医疗应用中。为了获得高质量的相位对比成像,Cellsorter构建了与微移液管同心排列的LED环。微移液管可以在显微镜上使用荧光或透明照明进行全自动操作。Cellsorter设想这项新技术不久将成为医学诊断中单细胞操作的标准工具,例如循环肿瘤细胞分离。

 

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